纳米抗体因 “小尺寸、高稳定、易改造” 的优势，已成为诊断试剂、药物研发的核心工具。但不同于传统抗体的杂交瘤制备法，纳米抗体需通过 “羊驼免疫 - 噬菌体文库构建 - 筛选 - 纯化” 的流程获取，很多新手因步骤细节把控不当导致实验失败。本文结合优化后的实操方案，从基础流程到关键技巧，带您一步步掌握纳米抗体制备，避开常见坑点。

一、第一步：羊驼免疫 —— 为文库提供 “多样化抗体基因”

1. 免疫流程（以 1 个抗原为例）

1. 抗原准备：抗原纯度需≥90%（构象正确的重组蛋白最佳），每只羊驼每次免疫剂量 0.5mg，与佐剂 1:1 乳化（确保形成稳定乳浊液，避免分层），总体积≤1.5mL；
2. 免疫操作：选择健康 “未免羊驼”（无既往免疫史），在颈部淋巴结附近分 2 侧、每侧 2 点皮下注射，每点约 0.4mL；免疫后观察 30 分钟，排除过敏反应；
3. 免疫周期：每 2 周免疫 1 次，至少进行 4 次（前 3 次为基础免疫，第 4 次为加强免疫）；
4. 采血与淋巴细胞分离：第 4 次免疫后 5-7 天，从颈部静脉采血 50mL——
   • 先 4000rpm、25℃离心 10 分钟分离血清（用于检测抗体效价）；
   • 取 15mL 血液缓慢叠加到 15mL 细胞分离液上（避免混匀），400×g、25℃离心 30 分钟，吸取中间棉状淋巴细胞层；
   • 用 PBS 洗涤淋巴细胞 2 次（400×g 离心 20 分钟），最后用 RNAiso Plus 按 10⁷细胞 /mL 的比例溶解，-80℃保存（避免反复冻融）。

2. 免疫关键技巧（避坑点）

• 羊驼与抗原选择：必须选 “未免羊驼”，避免既往免疫干扰；抗原需保持正确构象（如膜蛋白用去垢剂维持结构），否则难以产生特异性抗体；
• 淋巴细胞分离时机：采血后 1 小时内完成分离，避免血液溶血导致细胞破裂，影响后续 RNA 提取；
• 效价监测：每次免疫前采 5mL 血检测血清效价（ELISA 法），效价≥1:10⁴再进行加强免疫，确保淋巴细胞已产生针对目标抗原的抗体。

二、第二步：噬菌体文库构建 —— 打造 “多样化 VHH 基因库”

1. 核心流程

1. RNA 提取与反转录：
   • 取出冻存的淋巴细胞裂解液，加 1/5 体积氯仿震荡混匀，室温静置 5 分钟后，4℃、12000×g 离心 15 分钟，取上层水相（含 RNA）；
   • 加等体积异丙醇沉淀 RNA，室温静置 10 分钟后 4℃、12000×g 离心 10 分钟，用 75% 乙醇洗涤沉淀，晾干后用无 RNA 酶水溶解；
   • 用 Oligo dT 和 Random 引物分别反转录 RNA，获得 2 份 cDNA（覆盖不同长度的 VHH 基因，提升多样性）。
2. VHH 基因 PCR 扩增：
   • 第一轮 PCR（扩增重链抗体基因）：用 Alpa001F/Alpa001R 引物，以 cDNA 为模板，PCR 条件为 98℃ 3 分钟；95℃ 30 秒、57℃ 30 秒、72℃ 40 秒（每循环 + 2 秒），22 循环；72℃ 5 分钟；电泳后切取 0.7kb 条带（含 VHH 基因）纯化；
   • 第二轮 PCR（优化 VHH 基因两端酶切位点）：用 Alpa002F/Alpa002R 引物，以第一轮产物为模板，98℃ 3 分钟；95℃ 50 秒、55℃ 30 秒、72℃ 40 秒，12 循环；72℃ 10 分钟；纯化产物备用。
3. 克隆与电转化：
   • 将 VHH 基因与噬菌粒载体（如 pCANTAB5E）用相同酶切（如 SfiI），纯化后用 T4 DNA 连接酶连接；
   • 电转前将电转杯预冷，取 50μL TG1 感受态（转化效率≥10⁹ cfu/μg DNA）与 100ng 连接产物混合，电转后立即加 1mL SOC 培养基，37℃复苏 60 分钟；
   • 涂氨苄抗性 LB 平板，37℃过夜培养，次日用 2×YT 培养基刮下菌落，加 20% 甘油，-80℃保存为 “菌库”；取部分菌库按比例加入辅助噬菌体（M13K07），30℃过夜培养后，用 PEG8000/NaCl 沉淀噬菌体，获得 “噬菌体文库”。

2. 文库构建避坑点

• RNA 完整性：提取后用琼脂糖电泳验证（28S/18S 条带清晰），避免 RNA 降解导致 VHH 基因丢失；
• 转化效率：TG1 感受态需选高转化效率款，至少进行 20 次电转，确保文库库容≥10⁸（库容不足会遗漏高亲和力序列）；
• 辅助噬菌体比例：按 “辅助噬菌体：细菌 = 20:1” 添加，确保每个细菌都被感染，提升噬菌体产量。

三、第三步：抗体筛选 —— 从文库中 “钓出” 特异性 VHH

1. 淘选流程（3 轮，逐轮提高筛选严格性）

1. 抗原包被：第一轮用 50μg 抗原溶于 2mL PBS，加入免疫管 4℃旋转过夜；第二轮、第三轮抗原量减半（25μg、12.5μg），增加筛选压力；
2. 封闭与孵育：用 3% BSA 封闭免疫管和噬菌体文库（室温 2 小时），将封闭后的噬菌体加入免疫管，室温旋转孵育 1 小时；
3. 清洗与洗脱：用含 0.1% 吐温的 PBS 洗 20 次（每次 5 分钟），去除非特异性结合噬菌体；加 1mL 0.25mg/mL 胰蛋白酶，室温洗脱 30 分钟，加 10μL 10% AEBSF 终止；
4. 扩增与效价检测：取洗脱液感染 TG1 菌，37℃培养后涂板，计算效价 —— 每轮效价应比上一轮高 10-100 倍，说明特异性噬菌体已富集。

2. ELISA 鉴定（确认阳性克隆）

1. 挑取第三轮淘选后的单克隆（至少 192 个），接种到 96 孔板，37℃培养 5 小时后加辅助噬菌体，30℃过夜培养；
2. 离心取上清（含噬菌体展示的 VHH），将抗原包被酶标板（1ng/μL，pH9.4 CBS 缓冲液），4℃过夜；
3. 用 3% BSA 封闭酶标板，加入噬菌体上清室温孵育 2 小时，洗板后加 HRP 标记的抗 M13 抗体，显色后测 OD450 值；
4. 选取 “抗原孔 OD450/BSA 对照孔 OD450≥3” 的克隆测序，获得特异性 VHH 基因序列。

四、第四步：表达纯化 —— 获得功能性纳米抗体

1. 大肠杆菌表达（快速验证）

• 流程：将 VHH 基因克隆到 pET 载体，转化 BL21 菌株，IPTG 诱导表达（37℃ 4-6 小时）；裂解菌体，取上清用 Ni 柱亲和层析（VHH 带 His 标签）纯化；
• 优势：1-2 天可获得蛋白，适合初期结合活性验证；
• 避坑点：部分 VHH 会形成包涵体，可降低诱导温度（16℃）或换用低温表达菌株。

2. 毕赤酵母表达（规模化生产）

• 流程：将 VHH 基因克隆到 pPICZα 载体，线性化后电转 GS115 菌株，甲醇诱导表达（胞外分泌）；离心取上清，用离子交换层析 + 分子筛纯化；
• 优势：胞外分泌无需破菌，蛋白纯度高（杂蛋白少），且酵母的氧化环境利于 VHH 形成二硫键（维持稳定性）；
• 应用：适合需要高纯度、大规模的场景（如诊断试剂、药物研发）。

总结